Von high abgeleitete perivaskuläre Netzwerksegmentierungen

Jun 26, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 9205 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ein benutzerdefinierter Segmentierungsworkflow wurde auf Ex-vivo-Hochfeld-MR-Bilder von Rattengehirnen angewendet, die nach einer intraventrikulären Kontrastmittelinfusion in vivo aufgenommen wurden, um Karten der perivaskulären Räume (PVS) zu erstellen. Die resultierenden perivaskulären Netzwerksegmentierungen ermöglichten die Analyse der perivaskulären Verbindungen zu den Ventrikeln, der parenchymalen Clearance gelöster Stoffe und des dispersiven Transports gelöster Stoffe innerhalb des PVS. Zahlreiche perivaskuläre Verbindungen zwischen der Gehirnoberfläche und den Ventrikeln deuten darauf hin, dass die Ventrikel in ein PVS-vermitteltes Clearance-System integriert werden und die Möglichkeit eines Rückflusses von Liquor cerebrospinalis (CSF) aus dem Subarachnoidalraum über PVS in die Ventrikel erhöhen. Unter der Annahme eines schnellen Austauschs gelöster Stoffe zwischen den PVS- und CSF-Räumen hauptsächlich durch Advektion verringerte das ausgedehnte perivaskuläre Netzwerk die mittlere Clearance-Distanz vom Parenchym zum nächstgelegenen CSF-Kompartiment, was zu einer mehr als 21-fachen Verkürzung der geschätzten Zeitskala der diffusiven Clearance führte, unabhängig von der Diffusivität der gelösten Stoffe . Dies entspricht einer geschätzten diffusiven Clearance-Zeitskala von weniger als 10 Minuten für Amyloid-Beta, was darauf hindeutet, dass die weite Verbreitung von PVS die Diffusion zu einem wirksamen parenchymalen Clearance-Mechanismus machen könnte. Eine zusätzliche Analyse der oszillierenden Dispersion gelöster Stoffe innerhalb von PVS weist darauf hin, dass Advektion und nicht Dispersion wahrscheinlich der primäre Transportmechanismus für gelöste Verbindungen mit mehr als 66 kDa in den hier identifizierten langen (> 2 mm) perivaskulären Segmenten ist, obwohl die Dispersion für kleinere Verbindungen in kürzeren Abschnitten von Bedeutung sein kann perivaskuläre Segmente.

Blutgefäße im Gehirn sind von schlanken perivaskulären Räumen (PVS) umgeben, die den Flüssigkeitsaustausch zwischen den Kompartimenten interstitielle Flüssigkeit und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) ermöglichen1. Diese Strukturen haben in letzter Zeit viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da sie möglicherweise eine Rolle bei einem hirnweiten Clearance-Mechanismus für toxische Stoffwechselabfälle wie Amyloid-Beta (Aβ) spielen, das Protein, das sich bei der Alzheimer-Krankheit ansammelt2. Während eine schnelle Bildgebungs-Traceraufnahme aus dem Liquor3,4 und eine Clearance aus dem Parenchym5 beobachtet wurden, besteht Unsicherheit1 hinsichtlich des Mechanismus und der Richtung des Transports6,7,8, der Anatomie der arteriellen, kapillaren und venösen perivaskulären Transportwege5 und der Wirkung von Aquaporin-Wasserkanäle2 und Schlaf9 beim Transport. Dennoch kann der PVS-vermittelte Transport im Gehirn erhebliche Auswirkungen nicht nur auf neurodegenerative Erkrankungen haben, sondern auch auf die Arzneimittelabgabe an das Gehirngewebe10 und die Migration von Hirntumoren11,12 und Immunzellen13.

Während eine Reihe von Studien die Aufnahme von bildgebenden Tracern in PVS nahe der Gehirnoberfläche gezeigt haben3,4,14, haben nur wenige tiefer liegende PVS und ihre Verbindungen zum Liquor in den Hirnventrikeln und Zisternen untersucht15,16. Histologische Schnitte nach der Traceraufnahme deuten auf ein komplexes und umfangreiches PVS-Netzwerk im gesamten Gehirn hin17, aber die Auflösung der Bildgebung des gesamten Gehirns in vivo beschränkt die Analyse des intakten perivaskulären Netzwerks auf nur die größten Gefäße17,18,19. Es besteht Bedarf an einer 3D-Karte des gesamten Gehirns der wichtigsten perivaskulären Strukturen, um die für die Clearance relevanten perivaskulären Netzwerkeigenschaften zu analysieren, wie z. B. Verbindungen zu internen CSF-Räumen, die Verteilung von PVS im Parenchym und die Länge des perivaskulären Segments. Eine PVS-Karte würde die Bewertung potenzieller perivaskulärer und parenchymaler Transportmechanismen wie Diffusion, Dispersion und Advektion durch mehrskalige mechanische Modellierung ermöglichen. Dies ist erforderlich, um die Abfallbeseitigung besser zu verstehen und eine Vielzahl von Techniken zur Medikamentenverabreichung, einschließlich intravenöser, intrathekaler und konvektionsverstärkter Verabreichung an das Parenchym, genau zu planen.

Obwohl eine Segmentierung des intakten perivaskulären Netzwerks bei Ratten nach Kenntnis der Autoren nicht veröffentlicht wurde, wurden mehrere halbautomatische Strategien entwickelt, um menschliches PVS in klinischen MR-Bildern zu segmentieren20,21,22,23,24,25. Bei vielen dieser Strategien wird die „Röhrenheit“ oder „Gefässigkeit“ des Bildes durch die Anwendung von Frangi-Filtern26 bestimmt, die auf der räumlichen Krümmung der Bildintensität basieren. Durch Anwenden eines Schwellenwerts auf diese Röhrenbilder wird eine PVS-Segmentierung erstellt und in eine größere Segmentierungsmethodik integriert, die häufig auf Deep-Learning-Techniken basiert20,21. Trotz seiner Verbreitung in der menschlichen perivaskulären Segmentierung wurde die Tubeness Thresholding bisher nicht auf die Segmentierung von PVS bei Ratten oder Mäusen angewendet, hauptsächlich weil die Auflösung von In-vivo-MR-Bildern, die während der Verabreichung von zerebrospinalem Kontrastmittel aufgenommen wurden, nicht hoch genug ist, um die meisten PVS, die das Kontrastmittel enthalten, aufzulösen.

Magdoom et al.16 präsentieren eine Reihe von Ex-vivo-Bildern des Gehirns von Ratten mit 40 μm großen isotropen Voxeln, die bei 17,6 T nach intraventrikulärer Kontrastmittelinfusion aufgenommen wurden und zahlreiche Verbindungen zwischen dem perivaskulären Netzwerk und den Hirnventrikeln offenbaren. In der vorliegenden Studie wurden diese Bilder neu verarbeitet, um klarere Visualisierungen des perivaskulären Netzwerks zu erstellen, die die Identifizierung wichtiger Blutgefäße erleichtern, die von patentiertem PVS umgeben sind. Um hochauflösende 3D-Karten des PVS mit Kontrastmittel nach intraventrikulärer Infusion zu erstellen, wurde ein benutzerdefinierter Segmentierungsworkflow auf Basis der Tubeness entwickelt. Die resultierenden Karten wurden verwendet, um die perivaskulären Segmente in der Nähe der Ventrikel und Zisternen zu isolieren, die als Durchgangswege vom Parenchym zu tiefen Liquorräumen dienen könnten. Es wurde quantifiziert, inwieweit das PVS die Beseitigung parenchymaler Abfälle erleichtert, indem es die Transportentfernung zur nächstgelegenen CSF-Senke verringert. Außerdem wurde ein analytisches Transportmodell entwickelt, um die durch oszillierende perivaskuläre Strömung verursachte Dispersion als potenziellen Transportmechanismus für gelöste Stoffe in den längsten gemessenen PVS-Segmenten zu bewerten.

Nach intraventrikulärer Infusion wurde eine umfangreiche perivaskuläre Aufnahme von Gd-DTPA-Albumin im gesamten Gehirn beobachtet. Lange perivaskuläre Segmente, von denen einige über 3 mm lang sind, erstrecken sich von der Oberfläche des Gehirns bis zu den tiefen Geweben rund um das Ventrikelsystem (Abb. 1). Die PVS sind als helle, schmale Streifen im koronalen Bereich (Abb. 1a–h, Zusatzvideo S1 und S2), sagittal (Abb. 1i–n, Zusatzvideo S3 und S4) und transversal (Abb. 1o–t, Zusatzvideo S5 und S6) Flugzeuge. PVS, die subkortikal durchdringende Arterien (Scop) umgeben, durchqueren den Kortex zur subkortikalen weißen Substanz und zum periventrikulären Gewebe und bieten so potenzielle Pfade für Tracer zwischen dem dorsalen Subarachnoidalraum und den lateralen Ventrikeln (Abb. 1a–c, f, j, m). Aufgrund der dichten Anordnung heller, radialer Streifen (Abb. 1e–h) erfolgte wahrscheinlich eine perivaskuläre Aufnahme entlang kleinerer kortikaler Gefäße (Cop), obwohl einzelne Gefäße nicht leicht zu unterscheiden sind.

Partielle Maximalintensitätsprojektionen (pMIPs). Jedes Panel ist eine Projektion über 30 Schnitte parallel zur koronalen (a–h), sagittalen (i–n) und transversalen (o–t) Ebene für Ratte 3 (a–d, i–k und o–q). und Rat 4 (e–h, ln und r–t). In alphabetischer Reihenfolge liegt bei jedem Tier jedes koronale Feld hinter dem vorhergehenden Feld, jedes sagittale Feld seitlich zum vorhergehenden Feld und jedes transversale Feld ventral des vorhergehenden Feldes. Bemerkenswerte Schiffe sind gekennzeichnet (siehe Ergänzungstabelle S1).

Die perivaskuläre Aufnahme war entlang der wichtigsten ventralen Oberflächengefäße erkennbar, einschließlich der vorderen Hirnarterie (acer), der mittleren Hirnarterie (mcer), der hinteren Hirnarterie (pcer), der inneren Halsschlagader (ictd) und der Basilararterie (bas) (Abb. 1b, f, i, q, t). Äste dieser Hauptgefäße, die sich nach dorsal in den Schwanz und das Mittelhirn erstrecken, sind von den hellsten perivaskulären Segmenten in den Bildern umgeben und umfassen die Arteria striata anterior (astr), medial (mstr) und posterior (pstr), die ventralen Thalamusarterien (vth), und vordere Aderhautarterien (ach) (Abb. 1a–c, e–g, j–k, m–n). Einige dieser PVS scheinen mit den Ventrikeln kontinuierlich zu sein (Abb. 1b, c, f–g), obwohl die Auflösung nicht ausreicht, um festzustellen, ob sie anatomisch mit dem ventrikulären Liquor zusammenhängen oder sich in periventrikulärem Gewebe befinden, durch das gelöste Stoffe leicht diffundieren könnten oder zu den Ventrikeln fließen. PVS umgeben zahlreiche dorsal durchdringende Gefäße im Mittelhirn und im Hirnstamm, insbesondere in der Nähe der Längsfissur, einschließlich der Thalamo-Perforansarterien (THP), der Median-Mesenzephalie-Arterien (MMES), der Median-Pontin-Arterien (MPN) und der Median-Markarterien (MMD). ) (Abb. 1i, l). Letztere erstrecken sich in Richtung des vierten Ventrikels dorsal des Hirnstamms. PVS sind auch radial um das Aquädukt herum angeordnet und umgeben die periaquäduktalen Arterien lateral (lpaq) und dorsal (dpaq) sowie die medianen Pontinarterien (mpn) (Abb. 1d, h). Zusätzlich zur starken Kontrastverstärkung in den Ventrikeln und im PVS war eine schwächere Kontrastverstärkung in den quadrigeminalen und umgebenden Zisternen (ac) vorhanden (Abb. 1d, h, i–n, o, r). Die Aufnahme von Kontrastmittel in diese Zisternen ist bemerkenswert, da sie an die äußeren Liquorräume anschließen und von zahlreichen Blutgefäßen ausgekleidet sind27. Die perivaskulären Räume, die einige Zisternenblutgefäße (CBV) umgeben, sind in Abb. 1d, h, k, n erkennbar.

Die Bildsegmentierung ergab ein dichtes Netzwerk von PVS im gesamten Gehirn (Abb. 2, ergänzende Abb. S1) und zahlreiche PVS, die sich von der Nähe der Ventrikel bis zur Gehirnoberfläche und den Zisternen erstrecken (Abb. 3, markierte Gefäße). Die segmentierten PVS in Sätzen von 30 koronalen Schnitten (Abb. 2a, c, h, j) umfassen die überwiegende Mehrheit der PVS, die in den pMIPs für dieselben 30 Schnitte sichtbar sind (Abb. 1b, c, f, g). Die 3D-Struktur der perivaskulären Segmente (Abb. 2b, d, i, k) zeigt sowohl lange Segmente (Streifenarterien und subkortikal durchdringende Arterien) als auch kürzere Segmente innerhalb der Kortikalis und des Putamen caudatus. Bei diesen kürzeren Segmenten scheint es sich sowohl um kleinere perivaskuläre Räume nahe der Grenze der Bildauflösung als auch um Gefäße zu handeln, die senkrecht zur Koronalebene im caudaten Putamen ausgerichtet sind. Während die segmentierten PVS im Kortex, im Hirnstamm und in der Umgebung des Aquädukts im Allgemeinen weniger als 1 mm lang waren, waren mehrere perivaskuläre Segmente, die von Oberflächengefäßen stammten und in der Nähe der Ventrikel endeten, über 2,5 mm lang. Die durchgezogenen Darstellungen weisen darauf hin, dass keine Parenchymregion auffällig frei von PVS ist, obwohl eine Variabilität zwischen den Tieren in der kortikalen Aufnahme erkennbar ist (Abb. 2e – g, l – m, ergänzende Abb. S1). Die perivaskuläre Aufnahme von Kontrastmittel im Kortex, Striatum, periaquäduktalen Gewebe und im Hirnstamm wurde durch Berechnung des Prozentsatzes der als PVS segmentierten Voxel innerhalb der interessierenden Volumina (VOI) in jeder anatomischen Region quantifiziert (Tabelle 1). Das höchste durchschnittliche prozentuale Volumen (2,86 ± 0,934) wurde im Striatum beobachtet, während die übrigen Regionen durchschnittliche prozentuale Volumina zwischen 1,02 (periaquäduktales Gewebe) und 1,89 (Kortex) aufwiesen. Der prozentuale Anteil des segmentierten perivaskulären Volumens war im Kortex von Ratte 4 um 25 % größer als bei Ratte 3, was mit den 3D-Darstellungen in Abb. 2 übereinstimmt. Die MR-Bilder für Ratte 1 zeigten, dass bei diesem Tier das Kontrastmittel teilweise in das Periventrikular infundiert wurde Gewebe. Dies erklärt wahrscheinlich den höheren Prozentsatz des segmentierten perivaskulären Volumens im Striatum und den niedrigeren Prozentsatz des segmentierten perivaskulären Volumens im Periaquädukt und Hirnstamm, weit entfernt von der Infusionsstelle.

Perivaskuläre und ventrikuläre Segmentierung. Das PVS (gold) und die Ventrikel (blau), segmentiert in zwei Sätze von 30 zusammenhängenden koronalen Scheiben, werden auf den entsprechenden pMIPs für Rat 3 (a, c) und Rat 4 (h, j) überlagert. Diese pMIPs werden zum Vergleich mit Abb. 1b, c, f bzw. g mit überlagerten Segmentierungen dargestellt. Diese 30-Schicht-Segmentierungen werden zusammen mit ihren 3D-Renderings für Rat 3 (b, d) und Rat 4 (i, k) präsentiert. Alle PVS (gold) und die Ventrikel (blau) werden für Ratte 3 (e–g) und Ratte 4 (l–n) in 3D gerendert. Die Tafeln (e) und (l) sind eine rostrale Ansicht der Koronalebene, (f, m) eine dorsale Ansicht der Transversalebene und (g) und (n) eine linke Ansicht der Sagittalebene. Bemerkenswerte Schiffe sind gekennzeichnet (siehe Ergänzungstabelle S1).

Verbundene perivaskuläre Räume, die periventrikuläre Regionen einnehmen. Die Teile des perivaskulären Netzwerks, die Segmente enthalten, die einen Drei-Voxel-Rand um die Ventrikel durchqueren, werden für Ratte 3 (a–c) und Ratte 4 (d–f) dreidimensional gerendert. Die linke Spalte ist eine rostrale Ansicht der Koronalebene, die mittlere Spalte ist eine dorsale Ansicht der Transversalebene und die rechte Spalte ist eine linke Ansicht der Sagittalebene. Die Nadelspur jeder Ratte ist mit einem roten Stern gekennzeichnet. Bemerkenswerte Schiffe sind gekennzeichnet (siehe Ergänzungstabelle S1).

Die Isolierung des Teils des perivaskulären Netzwerks, der sich innerhalb eines schmalen Bereichs von maximal drei Voxeln von der Ventrikeloberfläche nach außen erstreckt, ergab Verbindungen zwischen den Seitenventrikeln und den großen ventralen Oberflächengefäßen über die A. choroideus anterior und die A. striata (Abb. 3a, c, d). , F). Ein Abstand von drei Voxeln wurde gewählt, da dieser Bereich schmal genug ist, um einen relativ schnellen Transport perivaskulärer Tracer in die Ventrikel zu ermöglichen. Es sind auch perivaskuläre Verbindungen von den Seitenventrikeln zur Rückenoberfläche über subkortikal durchdringende Arterien erkennbar (Abb. 3). Das PVS, das die transversalen Hippocampusarterien umgibt, die in den transversalen pMIPs sichtbar sind (Abb. 1o, r), scheint die kaudale Grenze der lateralen Ventrikel mit der umgebenden Zisterne zu verbinden (Abb. 3b, e). Der vierte Ventrikel befindet sich in der Nähe des PVS, der den Hirnstamm durchquert und sich rostral erstreckt (Abb. 3, f).

Der Mindestabstand zwischen jedem Parenchym-Voxel und dem nächstgelegenen Liquorraum wurde sowohl unter Berücksichtigung als auch ohne Berücksichtigung des PVS als Liquorraum berechnet (Abb. 4). Bei Ratte 4, einem Tier mit starker perivaskulärer Traceraufnahme, war das Parenchym ohne PVS im Durchschnitt 0,784 ± 0,516 mm vom nächsten Liquorraum entfernt, wobei einige Parenchymregionen mehr als 2 mm vom nächsten Liquorraum entfernt lagen (Abb. 4g). Diese Regionen bestanden aus Teilen des Kortex und des Mittelhirns (Abb. 4a – c). Wenn PVS als CSF-Kompartiment betrachtet wurde, verringerte sich der mittlere Mindestabstand zwischen Parenchym und CSF auf 0,169 ± 0,100 mm und alle Parenchym-Voxel lagen innerhalb von etwa 0,9 mm eines CSF-Raums (Abb. 4g). Diese Verringerung des Mindestabstands stellt eine über 21-fache Verkürzung der Zeitskala für die diffusive Clearance (siehe Gleichung (2a)) aus dem Parenchym dar (Abb. 4h). Der niedrigste durchschnittliche minimale Abstand (MCD) aller Tiere wurde im Striatum-VOI (0,150 ± 0,00438 mm) beobachtet, während der Kortex, das periaquäduktale Gewebe und der Hirnstamm-VOI Werte zwischen 0,215 mm (Hirnstamm) und 0,229 mm (Periaquädukt) aufwiesen. (Tabelle 1). Die maximale Standardabweichung des MCD bei allen Tieren betrug 62,4 μm im VOI des periaquäduktalen Gewebes. Unter der Annahme, dass im Parenchym ein interstitieller Fluss vorhanden wäre, wie in der glymphatischen Theorie postuliert, wurde geschätzt, dass das Vorhandensein von PVS die advektive Clearance-Zeitskala (siehe Gleichung (2b)) aus dem Parenchym um fast das Fünffache reduziert.

Mindestabstand zwischen Parenchym und Liquorräumen. Die Abstände zwischen Parenchymvoxeln und dem nächstgelegenen Liquorraum ohne PVS (a–c) und einschließlich PVS (d–f) für Ratte 4 werden als planare Farbbilder dargestellt. Die linke Spalte ist eine rostrale Ansicht der Koronalebene, die mittlere Spalte ist eine dorsale Ansicht der Transversalebene und die rechte Spalte ist eine linke Ansicht der Sagittalebene. (g) Verteilungen des Mindestabstands zwischen Parenchymvoxeln und den CSF-Räumen mit und ohne PVS. (h) Diffusive Transportzeitskalen für eine Reihe effektiver Diffusivitäten gelöster Stoffe mit und ohne PVS.

Eine transiente Transportanalyse in einem eindimensionalen semi-unendlichen Bereich (Abb. 5a) wurde durchgeführt, um festzustellen, ob die oszillierende Dispersion gelöster Stoffe die perivaskuläre Aufnahme erklären kann, die in unserem intraventrikulären Infusionsexperiment und nach der Infusion in die Cisterna magna beobachtet wurde, wie bereits berichtet2,14. 19. Unter der Annahme, dass die CSF-Räume gut gemischt waren und kurz nach Beginn der Infusion eine hohe Konzentration erreichten, führte der oszillierende perivaskuläre Fluss zu einem sich entwickelnden perivaskulären Konzentrationsgradienten, wobei sich führende Regionen mit niedriger Konzentration schneller bewegten als nachfolgende Regionen mit höherer Konzentration. Diese Regionen oder vorrückenden Fronten gelöster Stoffe werden durch ihren charakteristischen Anteil \(\alpha\) der CSF-Konzentration definiert. Für Albumin legte die \(\alpha\) = 0,1-Front etwa 1 mm in 40 Minuten zurück, während die \(\alpha\) = 0,8-Front in der gleichen Zeit etwa 150 μm zurücklegte (Abb. 5c). Im Vergleich dazu enthielten die Gehirne mit Kontrastmittel zahlreiche Segmente mit einer Länge von weit über 2 mm, einige bis zu 4 mm (Abb. 5b). Die Frontgeschwindigkeit war bei \(t\) = 0 maximal, da an der Grenze zum Liquor ein Konzentrationssprung vorlag (hier war der Konzentrationsgradient am größten) und betrug für \(\alpha\) knapp über 10 µm/s. = 0,1. Innerhalb einer Minute fiel die Geschwindigkeit für alle Fronten mit \(\alpha\) > 0,1 unter 2 μm/s (Abb. 5d). Die aufgrund der Schwingungsdispersion zurückgelegte Distanz variiert mit der Quadratwurzel des Diffusionskoeffizienten, was bedeutet, dass eine vierfache Änderung dieses Koeffizienten zu einer zweifachen Änderung der zurückgelegten Distanz führt. Die Zeiten, die die \(\alpha\) = 0,5-Front benötigt, um perivaskuläre Längen von 250 μm und 1000 μm für einen physiologisch relevanten Bereich molekularer Diffusivitäten und zwei Literaturwerte der dispersiven Verstärkung, \(k\), zu durchqueren, sind in Abb . 5e. Die Front des gelösten Albumins verzögerte sich zwischen 8,11 Minuten (\(k\) = 1,7)6 und 13,14 Minuten (\(k\) = 1,05)7, um 250 μm zu durchqueren, aber viel länger (2,16 Stunden bei \(k\) = 1,7). ), um 1000 μm zu durchlaufen, was mit dem Positions-Zeit-Diagramm (\(k\) = 1,05) in Abb. 5c übereinstimmt. Die gelöste Front für Aβ-Monomer (\(D\) = 180 μm2/s)28 war kleiner als Albumin und durchquerte beide Distanzen schneller, verzögerte sich jedoch immer noch um 1,00 h (\(k\) = 1,7) und 1,62 h (\ (k\) = 1,05), um 1000 μm zurückzulegen. Die gelöste Front für Natriumionen durchquerte 1000 μm in 11,36 Minuten (\(k\) = 1,05).

Oszillatorische Dispersion gelöster Stoffe in PVS. (a) Dispersionsmodellgeometrie bestehend aus einer gut gemischten CSF-Region mit konstanter Konzentration \(C_{1}\) und einem angrenzenden halbunendlichen geraden perivaskulären Segment anfänglich bei Konzentration \(C\) = 0. (b) Gemessene Längen für eine Stichprobe (n = 10) der längsten visuell identifizierbaren perivaskulären Segmente in Ratte 5. Die Datenpunkte wurden horizontal gestreut, um die Sichtbarkeit zu verbessern. (c) Position und (d) Geschwindigkeit vorrückender Tracerfronten mit Konzentrationen \(\alpha C_{1}\) über die Zeit (k = 1,05). (e) Zeit zum Durchqueren von 250 μm und 1000 μm für einen Bereich von Diffusivitäten gelöster Moleküle. Durchgezogene und gestrichelte Linien bezeichnen einen Anstieg des Diffusionskoeffizienten (dispersive Verstärkung) um 5 %7 (k = 1,05) und 70 %6 (k = 1,7), der durch oszillierende Strömung verursacht wird.

Eine schnell wachsende Zahl an Literatur legt nahe, dass das PVS mit den CSF-Räumen kommuniziert, um ein gehirnweites Flüssigkeitsaustausch- und Abfallbeseitigungssystem zu bilden1,29. Mehrere vorklinische Studien konzentrierten sich auf die dynamische Traceraufnahme aus dem Subarachnoidalraum in das kortikale PVS, wobei entweder In-vivo-Fluoreszenzmikroskopie oder Post-Mortem-Histologie zum Einsatz kam2,4,5. Während die Schädelfenstermikroskopie eine hochauflösende Echtzeitverfolgung des perivaskulären Transports ermöglicht, beschränken ein festes Sichtfeld und eine geringe Eindringtiefe die Analyse auf einen kleinen, oberflächlichen Teil des perivaskulären Netzwerks. Infolgedessen sind Ausmaß und Konnektivität des hirnweiten perivaskulären Netzwerks und seine funktionelle Beziehung zu den Hirnventrikeln und Zisternen nur unzureichend verstanden. Bedussi et al.15 beobachteten eine PVS-vermittelte Clearance zum Ventrikelsystem nach der Infusion in das Striatum, was darauf hindeutet, dass die Ventrikel als Clearance-Senke für tiefes Parenchymgewebe fungieren. Nach der Infusion in die Cisterna magna wurde auch ein starkes Tracersignal in periventrikulären und zisternen Geweben sowie in einem dichten Netzwerk perivaskulärer Strukturen in der Nähe der Ventrikel beobachtet17. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Tracer über tiefe parenchymale PVS zu den Ventrikeln gelangt, da der stromaufwärts gerichtete intraventrikuläre Transport gegen den ventrikulären Fluss weniger plausibel erscheint. Tatsächlich zeigen Daten der dynamischen kontrastmittelverstärkten MRT (DCE-MRT), die während der intrazisternalen Infusion erfasst wurden, dass sich das Kontrastmittel durch oberflächliche perivaskuläre Räume im gesamten Gehirn bewegt, bevor es das zerebrale Aquädukt erreicht, was darauf hindeutet, dass sich während der Infusion nur ein minimaler Tracer stromaufwärts durch das Ventrikelsystem bewegt18.

In dieser Studie befassen wir uns mit der Notwendigkeit einer hochauflösenden 3D-Visualisierung des perivaskulären Netzwerks der Ratte und seiner Verbindungen zu den inneren CSF-Räumen mithilfe von Hochfeld-Ex-vivo-MR-Bildern. Während mit der DCE-MRT in vivo eine perivaskuläre Aufnahme17,18,19 von Kontrastmittel nach Infusion in die Cisterna magna beobachtet wurde, beschränkte die Bildauflösung in diesen Studien die Analyse auf große Oberflächengefäße. Maximalintensitätsprojektionen durch Teilvolumina der hochauflösenden (40 μm isotrope Voxel) Ex-vivo-MR-Bilder von Magdoom et al.16 zeigten zahlreiche perivaskuläre Segmente, die offenbar einen direkten Weg zwischen den Außenflächen des Gehirns und den tiefen Geweben darstellen umgibt die Hirnventrikel (Abb. 1a–c, e–g). Einige dieser Segmente waren zwischen 2 und 4 mm lang (Abb. 5b). Auf der Rückenfläche gehören dazu die subkortikalen Penetrationsarterien (Scop), von denen einige nach Durchquerung der Kortikalis parallel zu den Bahnen der weißen Substanz verlaufen. Perivaskuläre Äste von großen ventralen Oberflächengefäßen, einschließlich der A. choroidealis anterior (ACH), der A. striata (astr, mstr, pstr) und der A. medullaris medianus (mmd), schienen nahe an den ventrikulären Oberflächen zu verlaufen oder in deren Nähe zu enden, obwohl die Auflösung reicht nicht aus, um zu bestimmen, ob sie anatomisch mit dem ventrikulären Liquor zusammenhängen oder sich in periventrikulärem Gewebe befinden, durch das gelöste Stoffe durchaus zu den Ventrikeln diffundieren oder fließen könnten. Es waren zahlreiche perivaskuläre Verbindungen zwischen der umgebenden Zisterne und den Ventrikeln entlang der transhippocampalen Arterien (trhi) und periaquäduktalen Arterien (lpaq, dpaq) erkennbar. Die Clearance-Funktion des Trhi-PVS könnte für die Alzheimer-Krankheit besonders relevant sein, da Plaquebildung und Atrophie im Hippocampus ein Merkmal der Krankheit sind30.

Die Geometrien des PVS, das von den großen ventralen und dorsalen Oberflächengefäßen in das Gehirn eindringt, stimmen mit veröffentlichten zerebrovaskulären Atlanten von Ratten und Mäusen überein. Bei der Identifizierung der Blutgefäßgruppen, die perivaskuläre Wege für gelöste Stoffe von der Gehirnoberfläche zu den Ventrikeln bereitstellen könnten, wurde auf umfangreiche Bilder des in Scremin31 präsentierten Gefäßsystems der Ratte verwiesen. Subkortikal durchdringende Arterien (Scop) durchqueren den Kortex mit minimaler Verjüngung zur subkortikalen weißen Substanz31,32,33 und in einigen Fällen zum periventrikulären Parenchym31. Lange Äste mit relativ konstantem Durchmesser, die von großen ventralen Oberflächengefäßen ausgehen, durchqueren das Putamen caudatus und andere subkortikale Strukturen, von denen sich viele bis zum periventrikulären Parenchym erstrecken31,32.

Das Vorhandensein perivaskulärer Bahnen von der Außenoberfläche des Gehirns zum die Ventrikel umgebenden Gewebe sowie wiederholte frühere Beobachtungen einer schnellen Traceraufnahme entlang durchdringender Arteriolen erhöhen die Möglichkeit eines CSF-Transports vom Subarachnoidalraum zu den Ventrikeln über das PVS. In diesem Fall würde der parenchymale Abfall zumindest teilweise durch den Liquor-Rückfluss in die Ventrikel abtransportiert werden, wodurch ein hirnweiter Clearance-Kreislauf entsteht. Obwohl sie sich geringfügig von dem von Iliff et al.3 vorgeschlagenen glymphatischen Kreislauf unterscheiden, bei dem einströmender periarterieller Liquor durch das Parenchym fließt und schließlich über perivenuläre Räume abfließt, schließen sich diese Zirkulationen nicht gegenseitig aus. Leider geben unsere MRT-Daten keinen Hinweis auf die Richtung des Kontrastmitteltransports, um den perivaskulären Liquorrückfluss in die Ventrikel direkt zu unterstützen. In unserem Experiment ist es möglich, dass der perivaskuläre Transport während der Infusion aufgrund des erhöhten ventrikulären Drucks von den Ventrikeln nach außen verlief, anstatt sich vor der Aufnahme in das PVS entlang des ventrikulären Netzwerks zum Subarachnoidalraum zu bewegen. Allerdings wurden diese Experimente mit dem Ziel durchgeführt, das perivaskuläre Netzwerk zu skizzieren und nicht, um die natürliche Entwicklung des Tracers im Laufe der Zeit zu verfolgen. Ersteres erforderte die Infusion einer großen Menge Kontrastmittel, um im ausgedehnten perivaskulären Netzwerk ausreichend Kontrast für die Visualisierung mit der MRT zu entwickeln. Dennoch ist es erwähnenswert, dass eine frühere Infusionsstudie mit einer höheren Flussrate (1,6 μl/min) über einen längeren Zeitraum (60 min) nur geringfügige Veränderungen im Hirndruck hervorrief34. Die Kombination von In-vivo-MRT während der Kontrastmittelinfusion in den Liquor und Ex-vivo-Bildgebung des gesamten Gehirns mit höherer Auflösung ist erforderlich, um die gehirnweite perivaskuläre Zirkulation zu beobachten und die oben beschriebenen hypothetischen Flussmuster zu bewerten.

Die glymphatische Theorie geht davon aus, dass Abfälle aus dem Parenchym entfernt werden, indem der Großteil der interstitiellen Flüssigkeit vom PVS, das die Arterien umgibt, zum PVS, das die Venen umgibt, fließt2. Diese Annahme des Flusses steht offenbar im Widerspruch zu den Erkenntnissen aus Echtzeit-Iontophorese-Studien (RTI), die darauf hindeuten, dass Diffusion die primäre Art des Transports gelöster Stoffe im Parenchym ist35 und wurde bald durch rechnerische Studien in Frage gestellt, die nahelegten, dass unphysikalische Druckgradienten erforderlich wären, um den advektiven parenchymalen Transport anzutreiben6 ,36,37,38. Eine spätere Computermodellierungsstudie zeigte, wie ein langsamer interstitieller Fluss die in früheren RTI-Studien beobachteten Fehler erklären könnte, und argumentierte, dass der parenchymale Transport wahrscheinlich eine Kombination aus Advektion und Diffusion ist39.

In dieser Studie betrachten wir die Frage der parenchymalen Clearance aus geometrischer Sicht, die durch unsere perivaskuläre Raumsegmentierung ermöglicht wird. Durch Berechnung des kürzesten Abstands von jedem Parenchym-Voxel zur Gehirnoberfläche oder zu den Ventrikeln wurde die räumliche Verteilung des minimalen Abstands (MCD) vom Parenchym zum nächstgelegenen Liquorraum bestimmt. Für Ratte 4 betrug die MCD durchschnittlich 0,784 mm, was einer Diffusionszeitskala für Aβ (\(D^{*}\) = 62,3 μm2/s28) von 2,74 h entspricht. Durch die Betrachtung des PVS als Erweiterung des CSF-Kompartiments wurde die durchschnittliche MCD auf 0,169 mm und die Diffusionszeitskala für Aβ um das 21-fache auf 7,67 Minuten reduziert. Die allgegenwärtige Natur des perivaskulären Netzwerks und sein schneller, hauptsächlich advektiver Austausch gelöster Stoffe mit dem Liquor scheinen die Diffusion zu einem praktikablen Mechanismus der Aβ-Clearance aus dem Parenchym zu machen. Diese Möglichkeit ist analog zum systemischen diffusiven Austausch gelöster Gase zwischen Blutkreislauf und Gewebe und wurde in früheren Übersichten im Zusammenhang mit der PVS-vermittelten Clearance angesprochen40,41. Darüber hinaus wurde die durchschnittliche MCD wahrscheinlich überschätzt, da kleinere perivaskuläre Segmente eine höhere Auflösung zur Unterscheidung erfordern. Zuvor berichtete räumliche Verteilungen der Peclet-Zahl im Gehirn von Ratten für intrathekal infundierte Gadotersäure (Gd-DOTA), die aus DCE-MRT-Bildern abgeleitet wurden, deuten auf einen Übergang vom hauptsächlich advektiven Transport in CSF-Räumen und größeren PVS zu einem hauptsächlich diffusiven Transport im Parenchym hin42. Dies steht im Einklang mit hydraulischen Netzwerkmodellen des PVS und des Parenchyms38,43, die meist mittlere bis hohe Peclet-Zahlen im PVS (\(Pe\) > 0,1), aber überwiegend niedrige Peclet-Zahlen (\(Pe\) < 0,1) im Parenchym vorhersagen. Natürlich verringerte die durch das perivaskuläre Netzwerk verursachte Verringerung der Clearance-Distanz auch die Clearance-Zeitskala unter der Annahme eines rein advektiven parenchymalen Transports, wenn auch weniger dramatisch, um den Faktor 4,63. Wenn tatsächlich eine interstitielle Massenströmung vorhanden wäre, würde der Transport als eine Kombination aus Advektion und Diffusion ablaufen, wie durch die Peclet-Zahl \(Pe\) für eine bestimmte Substanz vorgegeben. Beispielsweise würde eine interstitielle Geschwindigkeit von 0,367 µm/s zu gleichen advektiven und diffusiven Zeitskalen (\(Pe\) = 1) für Aβ über der durchschnittlichen MCD führen, wenn PVS als CSF-Kompartiment betrachtet wird.

Die schnelle perivaskuläre Aufnahme von CSF-Tracern scheint auf arteriellen Pulsationen zu beruhen3,44,45, aber der Mechanismus, durch den Pulsationen den perivaskulären Transport antreiben, ist nicht klar41. Durch periodische Variation des perivaskulären Volumens wird erwartet, dass arterielle Pulsationen eine oszillierende Flüssigkeitsbewegung im PVS erzeugen, eine Vorhersage, die indirekt durch die oszillierende Bewegung perivaskulärer Tracer bestätigt wurde46,47. Gefäßpulsationen können durch einen peristaltischen Mechanismus eine Nettoflüssigkeitsbewegung erzeugen48, obwohl diese Annahme durch Ergebnisse von Computermodellen6,49 und theoretisch durch die Feststellung, dass die Pulswellenlänge viel länger ist als die typische Länge des perivaskulären Segments, in Frage gestellt wird38. Die oszillierende Flüssigkeitsbewegung hat das Potenzial, den perivaskulären Tracer-Transport ohne Netto-Flüssigkeitsfluss durch die Taylor-Dispersion zu verbessern50, was als Erhöhung der effektiven Diffusionsfähigkeit des Tracers angenähert werden kann. Der dispersive Transport bei PVS wurde in jüngsten Computerstudien untersucht6,7,51. Asgari et al.6 prognostizierten einen Anstieg der effektiven Diffusionsfähigkeit von mehr als 27 %, während Troyetsky et al.7 einen bescheideneren Anstieg von etwa 5 % vorhersagten.

Hier untersuchten wir die dispersive perivaskuläre Aufnahme von Albumin, indem wir den perivaskulären Raum als einen geraden, halbunendlichen Kanal neben einem gut gemischten CSF-Kompartiment betrachteten und die Bewegung fortschreitender Tracerfronten mit Bruchteilen \(\alpha\) der CSF-Albuminkonzentration verfolgten . Vorrückende Fronten mit geringerer Konzentration bewegten sich schneller als Fronten mit höherer Konzentration (siehe Gleichung (6)). Beispielsweise bewegte sich die \(\alpha\) = 0,1-Front anfänglich mit etwas über 10 μm/s vor und legte in 40 Minuten etwa 1 mm zurück, während die \(\alpha\) = 0,8-Front anfänglich mit knapp 2 μm/s vorrückte und deckte in der gleichen Zeit nur etwa 150 μm ab (Abb. 5c). Diese vorhergesagte Penetrationsstrecke ist kürzer als die Länge vieler perivaskulärer Segmente (2–4 mm) und zeigt eine starke, relativ gleichmäßige Kontrastmittelverstärkung nach der 40-minütigen Infusion (Abb. 5b). Das Signal in diesen Segmenten wies keine axialen Konzentrationsschwankungen auf, wie man es von einem dispersiven Transportprozess erwarten würde. Die zuvor beobachtete Aufnahme in periarterielle Räume scheint schneller zu erfolgen als selbst die niedrigste Konzentrationsfront (\(\alpha\) = 0,1), die in der dispersiven Transportanalyse berücksichtigt wurde. Mikrosphären bewegen sich in den perivaskulären Räumen rund um die Pialarterien mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 18,7 μm/s4, während die \(\alpha\) = 0,1-Front nach 10 s auf 3,43 μm/s und nach 100 s auf 1,09 μm/s abfällt. Die Frontgeschwindigkeiten beim dispersiven Transport hängen auch vom Molekulargewicht ab, im Gegensatz zu Hinweisen auf einen vom Molekulargewicht unabhängigen Transport in periarteriellen Räumen18. Schätzungen der Geschwindigkeit gelöster Stoffe in oberflächlichen CSF-Räumen, einschließlich PVS, abgeleitet aus DCE-MRT durch die Theorie des optimalen Massentransports (rOMT), sind langsamer (~ 0,2 μm/s)42, diese Schätzungen basieren jedoch auf Voxeln, die größer als einzelne PVS sind, und spiegeln dies wahrscheinlich nicht wider perivaskuläre Geschwindigkeiten aufgrund der Volumenmittelung. Die durchschnittliche Peclet-Zahl in derselben CSF-Region lag dennoch bei etwa 80, was auf die Dominanz des advektiven Transports hinweist42. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass Advektion und nicht Dispersion der primäre perivaskuläre Aufnahmemechanismus für den Tracer in unserem Experiment und in früheren CSF-Infusionsstudien mit Tracern mit vergleichbarem Molekulargewicht war. Sorgfältige Experimente anderer Gruppen mit einem Doppelspritzensystem zur Aufrechterhaltung eines konstanten Liquorvolumens deuten ebenfalls darauf hin, dass die Aufnahme nicht durch einen erhöhten Infusionsdruck gesteuert wird52.

Die Dispersion wird natürlich einen größeren Transportbeitrag für Tracer mit höherer Diffusivität in kürzeren perivaskulären Segmenten leisten. Beispielsweise durchquerte die \(\alpha\) = 0,5-Front für Aβ-Monomer (\(D\) = 180 μm2/s)28, das kleiner als Albumin ist, 250 μm in 6,06 Minuten (\(k\) = 1,05). , benötigte aber 1,62 h (\(k\) = 1,05), um 1000 μm zurückzulegen (Abb. 5e). Die \(\alpha\) = 0,5 gelöste Front für Natriumionen durchquerte 1000 μm in 11,36 Minuten (\(k\) = 1,05) aufgrund der oszillatorischen Dispersion. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Oszillationsdispersion wesentlich zum Transport in kurzen perivaskulären Segmenten oder am Beginn langer perivaskulärer Segmente beitragen kann, mit zunehmender perivaskulärer Segmentlänge und zunehmendem Molekulargewicht des gelösten Stoffs jedoch an Bedeutung verliert. Selbst für die höhere dispersive Verstärkung (\(k\) = 1,7), die für \(D\) = 10 μm2/s in Asgari et al.6 berichtet wurde (die Verstärkung wird tendenziell kleiner mit zunehmender Diffusivität), benötigte das Aβ-Monomer 1,00 h, um 1000 μm zurückzulegen (Abb. 5e). Unter der Annahme, dass die in Mestre et al.4 beobachteten Strömungsgeschwindigkeiten (18,7 μm/s) in dem in dieser Studie beobachteten durchdringenden PVS vorhanden sind, würden gelöste Stoffe allein durch Advektion in 3,57 Minuten 4 mm (die Länge der längsten identifizierten perivaskulären Segmente) zurücklegen Dies legt nahe, dass ein effektiver CSF-Austausch durch die Advektion gelöster Stoffe in PVS besser möglich ist.

Die hier vorgestellten Visualisierungen und Segmentierungen des perivaskulären Netzwerks geben Einblick in die Struktur und Funktion des glymphatischen Systems. Es gibt zahlreiche lange perivaskuläre Segmente, die sich von der ventralen und dorsalen Oberfläche des Gehirns bis in die Nähe der Ventrikel und Zisternen erstrecken und als Wege für die Abfallbeseitigung zu diesen inneren Liquorräumen dienen und den glymphatischen Kreislauf in den größeren Liquorkreislauf integrieren können. Unter der Annahme eines schnellen Flüssigkeitsaustauschs zwischen den segmentierten PVS- und CSF-Räumen kann das PVS den durchschnittlichen Mindestabstand vom Parenchym zur nächstgelegenen CSF-Senke effektiv reduzieren und so die Zeitspanne, über die Parenchymabfall diese Distanz verteilen kann, um das 21-fache einer geschätzten Zeit reduzieren Skalierung über 2 Stunden auf eins unter 10 Minuten. Darüber hinaus legt eine Analyse des transienten Transports gelöster Stoffe innerhalb des PVS nahe, dass die Oszillationsdispersion nicht der vorherrschende Transportmechanismus für große Tracer in den längsten beobachteten perivaskulären Segmenten ist. Die Annahme einer schnellen Clearance aus dem PVS in der Parenchymtransportanalyse und die Unfähigkeit der Dispersion, Tracer in den beobachteten langen perivaskulären Segmenten schnell zu transportieren, legen nahe, dass ein Fluss im PVS erforderlich ist, um eine effektive Clearance im gesamten Parenchym durch Diffusion aufrechtzuerhalten. Der einströmende Liquor kann, wie zuvor vermutet, in das Parenchym filtern und/oder in Richtung der Ventrikel und Zisternen fließen, wie die in dieser Studie beobachteten PVS-Geometrien nahelegen. Aufgrund der geometrischen Vergrößerung des Strömungsquerschnitts mit der Entfernung vom eindringenden PVS und der geringen hydraulischen Leitfähigkeit im Parenchym wird erwartet, dass die Flüssigkeit, die vom PVS in das Parenchym eintritt, mit viel langsameren Geschwindigkeiten fließt als die im Pial-PVS beobachteten Geschwindigkeiten. In diesem Szenario würde der Parenchymtransport als eine Kombination aus Advektion und Diffusion ablaufen, wie durch die Peclet-Zahl \(Pe\) für eine bestimmte Substanz vorgegeben, was Diffusion als bedeutenden, wenn nicht sogar vorherrschenden Transportmechanismus im Parenchym nicht unbedingt ausschließt .

Das Versuchsdesign beinhaltete keine Möglichkeit, Arterien und Venen direkt zu unterscheiden, was es schwierig machte, festzustellen, ob sich Tracer im PVS von Venen befand. Bei Magdoom et al.16 war jedoch Evans-Blau-Farbstoff im Gewebe um den Sinus sagittalis superior erkennbar, was auf das Vorhandensein eines Tracers im venösen PVS hindeutet. Nur wenige Infusionsstudien haben gezeigt, dass Tracer die Venen umgeben1,2,17. Ein In-vivo-MR-Angiographie-Experiment vor der ventrikulären Infusion könnte Arterien und Venen unterscheiden, wenn auch mit geringerer Auflösung, und die Interpretation von hochauflösenden Ex-vivo-Bildern des PVS leiten.

Die Karten von PVS sind ausreichend aufgelöst, um die Netzwerkkonnektivität zu analysieren, Segmentmittellinien zu definieren, Segmentlängen zu messen und Änderungen im MCD zu berechnen. Aufgrund der Volumenmittelung innerhalb der 40-μm-Voxel können die Segmentierungen jedoch keine genaue Aussage über das perivaskuläre Volumen liefern. Kontrastmittel in perivaskulären Strukturen, die kleiner als 40 μm sind, können das Signal von mehreren 40 μm-Voxeln beeinflussen. Aufgrund der Volumenmittelung und der Kontrastmitteldiffusion vom PVS in das Parenchym im Verlauf der Infusion ist die tatsächliche Größe des PVS wahrscheinlich kleiner als ihre scheinbare Größe in den Ex-vivo-Bildern. Die relativ große Größe von Albumin (66 kDa) begrenzt jedoch seine Diffusion im Gehirngewebe (16,3 μm2/s53) und kann seinen Durchgang zwischen den Endfüßen der Astrozyten, die die äußere perivaskuläre Grenze auskleiden, behindern2. Die größere scheinbare Größe des PVS führt zu einer Unterschätzung des MCD. Wenn ein Gefäß mit einem Durchmesser von 17,85 μm an einem gemeinsamen Scheitelpunkt zwischen vier benachbarten Voxeln läge, die aufgrund der Signalverstärkung aufgrund der Volumenmittelung und der radialen Kontrastmitteldiffusion als perivaskuläre Voxel segmentiert sind, würde der minimale Abstand in der Ebene um höchstens 19,36 μm unterschätzt . Unter der Annahme, dass der Großteil der segmentierten PVS für Gefäße mit einem Durchmesser von etwa 17,85 μm bestimmt war54, würde die Berücksichtigung dieses zusätzlichen Abstands die durchschnittliche Diffusionstransportzeitskala für Aβ von 7,67 Minuten auf 9,53 Minuten erhöhen. Es ist vernünftig anzunehmen, dass ein solches Gefäß diese vier Voxel verstärken würde, da die Albuminkonzentration in diesen Voxeln aufgrund der radialen Albumindiffusion bei mindestens 45 % der perivaskulären Albuminkonzentration liegen würde, wenn man von einer konstanten perivaskulären Albuminkonzentration über 40 Minuten ausgeht (die Dauer von die intraventrikuläre Infusion).

Das Hirngewebe wurde nach der intraventrikulären Infusion fixiert, um eine weitere Albumindiffusion vor der Bildgebung zu verhindern. Durch die Fixierung schrumpft das Hirngewebe jedoch tendenziell leicht, was zu etwas verkleinerten Parenchym-Abstandsabständen führt. Ma, et al.55 berichten über eine durchschnittliche Gehirnschrumpfung aufgrund der Formalinfixierung bei Mäusen von 10,6 % anhand volumetrischer Messungen, die aus MRT-Bildern abgeleitet wurden. Dies entspricht einer Volumenzunahme von 11,9 % von der geschrumpften Geometrie zur In-vivo-Geometrie. Da das Volumen mit der dritten Potenz der Länge zunimmt, beträgt die entsprechende Zunahme des MCD 3,81 %. Die Diffusionszeitskala ist proportional zum Quadrat der Länge und würde sich um 7,76 % von 7,67 Minuten auf 8,26 Minuten erhöhen. Der Fehler in der MCD, der mit der scheinbaren Größe des PVS und der durch Fixiermittel induzierten Gehirnschrumpfung verbunden ist, führt zu geringfügigen Änderungen in der Diffusionszeitskala, die angesichts der Fülle perivaskulärer Räume nicht ausreichen, um die Diffusion als wirksamen Clearance-Mechanismus aus dem Parenchym zu untergraben.

Extrazelluläre Räume, einschließlich PVS, kollabieren nach der Tötung von Tieren, vermutlich aufgrund des Einstroms extrazellulärer Flüssigkeit in die Zellen und der daraus resultierenden Zellschwellung56,57. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die beobachteten PVS ein Artefakt ihres postmortalen Zusammenbruchs sind. Durch den Kollaps des PVS könnte möglicherweise das Kontrastmittel aus den Zwischenräumen herausgedrückt werden, was deren MRT-Sichtbarkeit beeinträchtigt und die Sichtbarkeit solcher Zwischenräume erschwert und sie nicht deutlicher macht. Alternativ könnte der Flüssigkeitseinstrom in Zellen nach dem Tod CSF und Kontrastmittel in das PVS ziehen, wie bei Du et al.57, und so deren Sichtbarkeit verbessern, aber dies sollte keine Räume markieren, die in vivo fehlten.

Der Ex-vivo-Ansatz verhinderte auch die direkte Beobachtung der Richtung und Geschwindigkeit des perivaskulären Transports. In-vivo-Bildgebung während der Infusion würde eine dynamische Tracer-Beobachtung auf Kosten der Bildauflösung ermöglichen. Alternativ oder ergänzend könnten Ex-vivo-Bilder nach Infusionen unterschiedlicher Dauer aufgenommen werden. Dieser Ansatz würde eine indirekte Beobachtung der perivaskulären Transportrichtung und -geschwindigkeit ohne Einbußen bei der Bildauflösung ermöglichen. In der Oszillationstransportanalyse wurde der perivaskuläre Zufluss aus dem SAS, der durch Gefäßpulsationen oder andere Quellen von Druckgradienten verursacht wird, nicht explizit modelliert. Diese Faktoren könnten in ein Modell des perivaskulären Flusses und des Transports gelöster Stoffe einbezogen werden, das die segmentierte Geometrie von PVS umfasst, um die Mechanik des glymphatischen Systems weiter zu untersuchen, indem simulierte Verteilungen gelöster Stoffe mit Daten aus den oben beschriebenen In-vivo- und Ex-vivo-Experimenten verglichen werden.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Florida genehmigt und entsprechen den relevanten Richtlinien und Vorschriften. Die hier beschriebenen Methoden entsprechen den Empfehlungen der ARRIVE-Richtlinien. In Magdoom et al.16 wurden hochauflösende Magnetresonanzbilder (40 \({\upmu }\)m isotrope Voxel) von PVS in fünf herausgeschnittenen ganzen Rattengehirnen aufgenommen. Gadolinium-markiertes menschliches Serumalbumin, Gd-DTPA-Albumin58, wurde 40 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 1,5 μL/min in den Seitenventrikel jeder anästhesierten Ratte (4 % Isofluran in 1 l/min Sauerstoff) infundiert, um eine Verteilung in den Ventrikel zu ermöglichen PVS. Das Tier wurde sofort entblutet und dann durch Gefäßperfusion mit 0,9 %iger Natriumchloridlösung und anschließender 4 %iger Formaldehyd-Fixierlösung getötet, um den Tracer mit dem Hirngewebe zu vernetzen. Nach 2,5–3 Tagen Lagerung bei 4 °C wurde das Rattenhirn herausgeschnitten und in Fluorinertöl (FC-43, 3 M Corp., St. Paul, MN, USA) gelegt, um die hochauflösende Bildgebung bei 17,6 T vorzubereiten ( Bruker Biospin, Billerica, MA, USA). Ein \(T_{1}\)-gewichtetes 3D-Gradientenechobild mit einem FOV von 20 mm × 16 mm × 12 mm, einer Matrixgröße von 500 × 400 × 300, TR = 100 ms, TE = 0,3 ms, Flipwinkel = 50°, und 7 Durchschnittswerte wurden in etwa 24 Stunden erfasst. Zwei naive Kontrolltiere wurden in jeder Hinsicht den gleichen Versuchs- und Bildgebungsprotokollen unterzogen, mit Ausnahme der stereotaktischen Operation und der intraventrikulären Infusion. Bei allen Tieren (n = 7) handelte es sich um 2 Monate alte männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 280 – 300 g.

Das Rattenhirn wurde in den MR-Bildern mit dem Nagetierhirn-Extraktionstool rBET59 isoliert und mit dem linearen Bildregistrierungstool FLIRT61 im Swanson-Atlas60 registriert, bevor in ImageJ62,63 wie bei Magdoom et al. Projektionen maximaler Intensität (MIPs) erstellt wurden. 16. Dies zeigte zwar das Ausmaß der perivaskulären Aufnahme im gesamten Gehirn, eine weitere Analyse des perivaskulären Netzwerks wurde jedoch durch den in dieser Studie vorgestellten benutzerdefinierten Visualisierungs- und Segmentierungsworkflow ermöglicht (Abb. 6). Weitere Einzelheiten zu den Tierversuchen und dem Bildgebungsprotokoll finden Sie in Magdoom et al.16.

Bildanalyse-Workflow. Nach der 24-stündigen MRT-Sitzung bei 17,6 T wurde das Gehirn extrahiert und mit einer benutzerdefinierten Projektionstechnik mit maximaler Intensität (blauer Kasten) sichtbar gemacht. Anschließend wurden die Gehirnregionen und das PVS segmentiert und in 3D gerendert (roter Kasten). Abschließend wurden die PVS-Ventrikel-Konnektivität und der Transport analysiert (grüner Kasten). Die in jedem Schritt verwendeten Softwareanwendungen sind, wie durch die hochgestellten Buchstaben angegeben, wie folgt: (a) rodent Brain Extraction Tool (rBET); (b) FMRIBs lineares Registrierungstool (FLIRT); (c) MATLAB r2018a; (d) BildJ; (e) itk-SNAP.

Die Ventrikel und PVS erscheinen in den \(T_{1}\)-gewichteten 3D-Bildern hell, da Gd-DTPA-Albumin \(T_{1}\)16 reduziert. Trotz des daraus resultierenden Kontrasts zum umgebenden Gewebe sind die PVS aufgrund ihrer geringen Größe, die sich manchmal über ein einzelnes Voxel erstreckt, und der unterschiedlichen Ausrichtung nicht sofort erkennbar. Die Berechnung einer Maximalintensitätsprojektion (MIP) der Daten, wie zuvor von Magdoom et al.16 berichtet, führt zu einer Reihe von Projektionsbildern, in denen die hellsten PVS und die Ventrikel deutlicher zu erkennen sind. Kleinere, schwächere PVS werden jedoch möglicherweise nicht projiziert und PVS können durch die hellen Ventrikel in der Mitte des Gehirns verdeckt werden. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden partielle Maximalintensitätsprojektionen (pMIPs) erstellt, indem durch 30 Voxel dicke rechteckige Volumina parallel zur Koronal-, Sagittal- und Transversalebene projiziert wurde. Da in aufeinanderfolgenden Projektionen häufig kontinuierliche perivaskuläre Segmente vorhanden waren, wurden verschiebende pMIPs (spMIPs) verwendet, um die gesamte Länge dieser Strukturen im gesamten Gehirn sichtbar zu machen (siehe Zusatzvideo S1 bis S6). Bei einem spMIP wird die Projektionsspanne für jedes 30-Voxel-Projektionsbild um ein einzelnes Voxel verschoben, statt um 30 Voxel wie bei einem pMIP.

Die PVS stellen aufgrund ihrer geringen Größe und der ungleichmäßigen Signalstärke des umgebenden Gewebes eine Herausforderung bei der Segmentierung dar. Da die PVS Blutgefäße umgeben, erscheinen sie in vielen Hirnregionen wie schlanke, röhrenförmige, helle Strukturen mit unterschiedlichen mittleren Intensitätswerten. Um sie besser von dieser vielfältigen Umgebung unterscheiden zu können, wurde in ImageJ64,65 ein Maß für die röhrenförmige Qualität oder Röhrenhaftigkeit des Intensitätsfeldes berechnet, das jedes Voxel umgibt. Die Tubeness eines bestimmten Voxels wurde als geometrisches Mittel der beiden negativsten Eigenwerte der Hesse-Matrix für dieses Voxel definiert. Die Hesseschen Matrixelemente sind die zweiten räumlichen Ableitungen des Bildintensitätsfeldes65

Die Matrixelementindizes \(i\) und \(j\) geben die Achsen an, entlang derer die Differenzierungen durchgeführt werden (siehe Ergänzungstabelle S2 für alle Variablen und Parameter). Die Eigenvektoren und Eigenwerte der Hesse-Matrix sind somit die Richtungen und Beträge der Hauptkrümmungen für das Intensitätsfeld. Für einen Bereich mit Pixeln hoher Intensität und Umgebungen geringerer Intensität sind die Eigenwerte negativ, \(0 > \lambda_{1} > \lambda_{2} > \lambda_{3}\), und jeder Eigenwert ist die Bildintensitätskrümmung entlang sein zugehöriger Eigenvektor. Für ein röhrenförmiges Intensitätsfeld gilt \(\lambda_{1} = 0\) und \(\lambda_{2} = \lambda_{3} \ll 0\)65, da die Intensität nicht entlang der Röhrenachse variiert, sondern schon negative Krümmung senkrecht zu dieser Achse. Dementsprechend ist in der ImageJ-Implementierung die Röhrenheit als \(\sqrt {\lambda_{2} \lambda_{3} }\) definiert und nimmt für röhrenförmigere Intensitätsfelder an Wert zu64. Bei dieser Implementierung kann das Tubeness-Feld durch Anwenden eines Gauß-Filters vor der Berechnung der Tubeness auf röhrenförmige Strukturen einer bestimmten Größe empfindlich gemacht werden. Da sich viele PVS nur über ein einzelnes Voxel erstrecken, wurde die Standardabweichung für den Gauß-Filter auf 40 μm festgelegt. Die Tubeness-Berechnung ist eine Variante der Frangi-Filterung26, einer Technik, die häufig auf klinische MR-Bilder zur perivaskulären Raumsegmentierung beim Menschen angewendet wird20,21,22,25.

Die perivaskulären Raumsegmentierungen wurden durch Berechnen der Röhrenstärke der 3D-Bilder und Auswählen von Voxeln mit einer Röhrenstärke über einem Schwellenwert generiert. Da das Kontrastmittel die Signalstärke deutlich über die Werte in den naiven Gehirnen hinaus erhöhte, wurden die Spitzen der Intensitätsverteilung für jedes Gehirn durch Anpassen des Datenbereichs vor der Bestimmung der Tubeness-Schwelle ausgerichtet (Abb. 7a, b).

Signalintensitäts- und Röhrenverteilungen. (a) Signalintensität vom Gehirn mit Kontrastmittel (Ratte 1–5) und ohne Kontrastmittel (Naiv 1–2). Die Signalintensität für jedes Tier wurde linear zwischen 0 und 1 abgebildet. (b) Signalintensität nach Neuzuordnung des Intensitätsbereichs, um Signalverteilungsspitzen auszurichten und einen besseren perivaskulären Kontrast zum umgebenden Gewebe zu erzeugen. (c–d) Tubeness-Verteilung für das Innere des Gehirns (c) und die Oberfläche (d). Die graue vertikale Linie ist der Durchschnitt der Tubeness-Werte, die dem kumulativen Verteilungswert von 0,95 in jedem naiven Gehirn entsprechen. Dieser Tubeness-Wert ist im Durchschnitt bei 95 % der naiven Voxel größer als die Tubeness.

Der Schwellenwert wurde so festgelegt, dass er die Tubeness-Werte von 95 % der Voxel in den naiven Gehirnen überschreitet (Tubeness = 3,75; Abb. 7c). Dies wurde durchgeführt, um eine Hintergrundröhre auszuschließen, die nicht mit der Aufnahme von Kontrastmittel in das PVS zusammenhängt. Die Außenflächen des Gehirns wiesen höhere Hintergrundröhrenwerte auf, da die Schnittstelle zwischen dem Parenchym und der dunklen Umgebung in den naiven Gehirnen hohe räumliche Intensitätsgradienten erzeugte. Daher wurde ein höherer Tubeness-Schwellenwert (Tubeness = 8,08) verwendet, um das PVS von Oberflächenblutgefäßen zu segmentieren (Abb. 7d).

Mehrere Segmentierungen anatomischer Strukturen, einschließlich der Ventrikel und des Kleinhirns, wurden in itk-SNAP66 erstellt, wobei sowohl manuelle Umrisse als auch das halbautomatische Segmentierungstool „Schlange“ zum Einsatz kamen. Das Ventrikelnetzwerk erschien aufgrund des infundierten Kontrastmittels hell, was die Segmentierung im Vergleich zum Gehirnatlas der Paxinos-Ratte erleichterte27. Die auf der Tubeness basierende Segmentierung des PVS wurde durch die Entfernung des Kleinhirns verbessert, da dessen innere Grenzen es schwierig machten, das PVS allein anhand der Tubeness zu unterscheiden. Die interessierenden Volumina (VOI) im Kortex, im Striatum, im periaquäduktalen Gewebe und im Hirnstamm über jeweils 30 koronale Schnitte wurden manuell umrissen, um den perivaskulären Voxelvolumenprozentsatz und die mittlere MCD in diesen anatomischen Regionen bei allen Tieren zu vergleichen (Abb. 8). Der Cortex und das Striatum VOI belegten den gleichen Satz von 30 Schnitten, und das Striatum wurde als das Gewebe ventral und medial des Cortex innerhalb dieser Schnitte definiert.

Gehirnvolumina von Interesse (VOI) für die Analyse der perivaskulären Raumsegmentierung. Ein koronaler Schnitt vom VOI im (a) Kortex, (b) Striatum, (c) periaquäduktalen Gewebe und (d) Hirnstamm. Jeder VOI umfasst 30 koronale Schichten.

Die Verbindungen zwischen dem PVS und dem Ventrikelnetzwerk wurden mit einem benutzerdefinierten Regionswachstumsalgorithmus untersucht, der die Ventrikelsegmentierung iterativ auf die perivaskuläre Segmentierung erweiterte. In jeder Iteration wurden perivaskuläre Voxel, die unmittelbar an ein Ventrikelvoxel angrenzten, zur wachsenden Ventrikelsegmentierung für insgesamt 100 Iterationen hinzugefügt. Vor Beginn dieses Verfahrens wurde die Ventrikelsegmentierung um drei Voxel vergrößert, um PVS innerhalb von 208 µm von der Ventrikeloberfläche zu erfassen, dem diagonalen Abstand über drei diagonal ausgerichtete kubische Voxel von 40 µm. Ein Abstand von drei Voxeln wurde gewählt, da diese Länge kurz genug ist, um einen relativ schnellen Transport perivaskulärer Tracer in die Ventrikel zu ermöglichen. Dies führte zu einer Segmentierung, die die Ventrikel und Teile des perivaskulären Netzwerks umfasste, die mit perivaskulären Segmenten in der Nähe der Ventrikel verbunden waren.

Schätzungen der PVS-Länge wurden für eine Auswahl langer, kontinuierlicher Segmente vorgenommen, die von der ventralen und dorsalen Gehirnoberfläche aus eindringen, und zwar unter Verwendung eines modifizierten Regionswachstumsalgorithmus. Ein Saatvoxel wurde am Oberflächenende jedes perivaskulären Segments platziert und der Schwerpunkt der nach jeder Wachstumsiteration hinzugefügten Voxel wurde aufgezeichnet. Die Abstände zwischen diesen Schwerpunkten wurden berechnet und summiert, um eine Schätzung der gesamten perivaskulären Segmentlänge zu erhalten.

Das Ausmaß, in dem das perivaskuläre Netzwerk den Austausch zwischen CSF und interstitieller Flüssigkeit erleichtert, wurde durch Berechnung des Abstands zwischen Parenchymvoxeln und dem nächstgelegenen CSF-Kompartiment, \(L\), quantifiziert, wobei das PVS sowohl als CSF-Raum berücksichtigt als auch nicht berücksichtigt wurde. In dieser Analyse wurden die PVS aufgrund zahlreicher Beobachtungen eines schnellen Austauschs zwischen PVS und größeren CSF-Räumen als CSF-Kompartimente betrachtet. Die Mindestabstände wurden durch Berechnung einer euklidischen Distanztransformation67 der CSF-Segmentierung in MATLAB (MATLAB v. 9.4.0.813654 (R2018a), The MathWorks, Inc., Natick, MA) bestimmt. Die Clearance-Zeitskalen \(\tau_{d}\) und \(\tau_{a}\) für einen Bereich relevanter Diffusivitäten gelöster Stoffe wurden unter der Annahme berechnet, dass entweder rein diffusiv (Gl. (2a)) oder advektiv (Gl. (2b)) ist. ) Transport durch das Parenchym.

In Gl. (2a) ist \(D^{*}\) die effektive Diffusionsfähigkeit des gelösten Stoffes im Parenchym und \(u\) die Größe der interstitiellen Geschwindigkeit. \(D^{*}\) ist aufgrund parenchymaler Strukturen, die die zufällige Bewegung gelöster Stoffe behindern, niedriger als die freie Diffusivität des gelösten Stoffes \(D\). Die Verkürzung der parenchymalen Clearancezeit aufgrund des perivaskulären Netzwerks wurde für einen physiologisch relevanten Bereich von \(D^{*}\)-Werten (101–103 µm2/s37) einschließlich des von Aβ (62,3 μm2/s28) geschätzt.

Ein perivaskuläres Transportmodell wurde entwickelt, um die oszillierende Dispersion gelöster Stoffe in den längsten perivaskulären Segmenten zu untersuchen, die in dieser Studie beobachtet wurden. Dieses Modell geht davon aus, dass der Liquor im Subarachnoidalraum gut gemischt ist und eine konstante Konzentration gelöster Stoffe \(C_{1}\) beibehält, während die perivaskulären Segmente zunächst freie Flüssigkeit mit einer Konzentration \(C_{0}\) = 0 enthalten Da die Segmente lang und schlank sind, wurde eine eindimensionale, halbunendliche Geometrie (Abb. 5a) in Betracht gezogen, deren Ursprung an der Schnittstelle zwischen dem CSF-Reservoir und dem perivaskulären Segment liegt. Dynamische Veränderungen der perivaskulären Geometrie aufgrund der Gefäßwandbewegung wurden nicht modelliert, da diese im Verhältnis zur perivaskulären Spaltbreite klein sind3,68. Die Dispersion aufgrund der oszillierenden Strömung in einem Ringraum wurde zuvor als verstärkter Diffusionsprozess modelliert, bei dem die freie Diffusionsfähigkeit des gelösten Stoffes \(D\) um den Faktor \(k\)6,7,50 erhöht wird. Der perivaskuläre Zufluss aus dem SAS, der durch Gefäßpulsationen oder andere Quellen von Druckgradienten verursacht wird, wurde nicht explizit modelliert; Es wurde nur der dispersive Effekt der oszillierenden Strömung auf die Entwicklung der Konzentration gelöster Stoffe berücksichtigt. Daher lautet die maßgebliche Gleichung für dieses Szenario

Angesichts des Fehlens einer geometrischen Längenskala wurde eine selbstähnliche Lösung für die dimensionslose Konzentration \(\alpha\) in Bezug auf die Variable \(\eta\) gesucht, wobei

Die selbstähnliche Lösung wird anhand der Fehlerfunktion als definiert

Die Position \(x\) und Geschwindigkeit \(v\) des materiellen Punktes mit einem Bruchteil \(\alpha\) der CSF-Konzentration \(C_{1}\) im perivaskulären Segment über die Zeit ist gegeben durch

Gleichung (6) stellt die Kinematik der dispersiven Traceraufnahme in das PVS dar. Rinderserumalbumin (\(D\) = 83 μm2/s53) mit maximaler Verstärkung \(k\) = 1,057 und \(k\) = 1,76 wurde als repräsentativer Tracer mit hohem Molekulargewicht angesehen.

Die Daten sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Robert Brasch (University of California, San Francisco) für die großzügige Bereitstellung des in dieser Studie verwendeten Gadolinium-Kontrastmittels. Die präsentierten Magnetresonanzbilder wurden in der Advanced MRI/S (AMRIS) Facility am McKnight Brain Institute an der University of Florida aufgenommen, einem Teil des National High Magnetic Field Laboratory (NHMFL), das durch das National Science Foundation Cooperative Agreement DMR unterstützt wird. 1157490, der Bundesstaat Florida und das US-Energieministerium. Diese Studie wurde teilweise von der Bobby Jones Chiari & Syringomyelia Foundation (bobbyjonescsf.org) und einem NHMFL-Benutzerstipendium finanziert. Wir danken auch Dr. Tavarekere N. Nagaraja vom Henry Ford Hospital in Detroit, MI, USA, für den Austausch seiner Erfahrungen mit CSF-Tracer-Verteilungen nach intraventrikulärer Infusion. Wir danken außerdem Rasheed M. Anjum für seine Unterstützung bei der Analyse der radialen Kontrastmitteldiffusion aus dem perivaskulären Raum.

Fakultät für Maschinenbau und Luft- und Raumfahrttechnik, University of Florida, PO BOX 116250, Gainesville, FL, 32611, USA

Julian A. Rey, Uzair M. Farid, Christopher M. Najjoum, Kulam Najmudeen Magdoom und Malisa Sartinoranont

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, University of Florida, Gainesville, FL, USA

Alec Brown & Thomas H. Mareci

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JAR unterstützte die intraventrikulären Infusionsexperimente an Tieren, entwarf und führte den Arbeitsablauf zur perivaskulären Raumsegmentierung und Transportanalyse durch und verfasste das Manuskript. UMF unterstützte bei der Entwicklung und Ausführung eines maßgeschneiderten Visualisierungs- und Segmentierungscodes für den perivaskulären Raum. CMN war für die manuelle Segmentierung der Ventrikel und des Kleinhirns verantwortlich. AB führte die vorläufige Gehirnsegmentierung und anatomische Registrierung durch. KNM führte die intraventrikulären Infusionsexperimente durch, bereitete die Proben vor, machte Bilder und leitete die vorläufige Bildverarbeitung. THM überwachte die Magnetresonanztomographie und trug zur Bildnachbearbeitung und den Strategien zur perivaskulären Raumsegmentierung bei. MS hat die intraventrikulären Infusionsexperimente konzipiert und finanziert. MS überwachte auch die Entwicklung des Arbeitsablaufs zur Visualisierung und Segmentierung des perivaskulären Raums, die Analyse des parenchymalen und perivaskulären Transports sowie die Erstellung des Manuskripts. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Malisa Sarntinoranont.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rey, JA, Farid, UM, Najjoum, CM et al. Perivaskuläre Netzwerksegmentierungen aus der Hochfeld-MRT und ihre Auswirkungen auf den perivaskulären und parenchymalen Massentransport im Rattengehirn. Sci Rep 13, 9205 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34850-0

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Eingegangen: 31. August 2022

Angenommen: 09. Mai 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34850-0

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